制備液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)：
一、制備液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況
色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相( phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。
色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。
二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)
HPLC有以下特點(diǎn)：
高壓—壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速—流速為0.1~10.0 ml/min。
高效—可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度—紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：
速度快—通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高—可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。
靈敏度高—紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
柱子可反復(fù)使用—用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收—樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
三、色譜法分類(lèi)
按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動(dòng)相(常用CO2)，因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱(chēng)分子篩、凝膠過(guò)濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。(此外還有電泳。)
按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。
1.液固色譜法
使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2.液液色譜法
使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性;流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
3.正相色譜法
采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等)。
4.反相色譜法 一般用非極性固定相(如C18、C8);流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8)，太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動(dòng)相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出
從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明顯的界線(如氨基鍵合固定相)。
5.離子交換色譜法
固定相是離子交換樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱(chēng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂)或季氨基(陰離子交換樹(shù)脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹(shù)脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。
6.離子對(duì)色譜法
又稱(chēng)偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。
分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對(duì)色譜法常用ODS柱(即C18)，流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。
7.排阻色譜法
固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng);大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
被分離組分在柱中的洗脫原理
II.基本概念和理論
一、基本概念和術(shù)語(yǔ)
1.色譜圖和峰參數(shù)
色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱(chēng)色譜流出曲線(elution profile)。
基線(base line)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。
噪音(noise)——基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。
色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)稱(chēng)形正態(tài)分布曲線(高斯Gauss曲線)。不對(duì)稱(chēng)色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)。
拖尾因子(tailing factor，T)——T=，用以衡量色譜峰的對(duì)稱(chēng)性。也稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)因子(symmetry factor)或不對(duì)稱(chēng)因子(asymmetry factor)。《中國(guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T<0.95為前延峰，T>1.05為拖尾峰。
峰底—基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。
峰高(peak height，h)—峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。
峰寬(peak width，W)—峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W=4σ
半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)—峰高一半處的峰寬。Wh/2=2.355σ
標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，σ)—正態(tài)分布曲線x=±1時(shí)(拐點(diǎn))的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高;反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面積(peak area，A)—峰與峰底所包圍的面積。A=×σ×h=2.507σh=1.064 Wh/2h
2.定性參數(shù)(保留值)
死時(shí)間(dead time，t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相(溶劑)通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。
死體積(dead volume，V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動(dòng)相占據(jù)，Vm)、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0=F×t0(F為流速)
保留時(shí)間(retention time，tR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。
保留體積(retention volume，VR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱(chēng)洗脫體積。VR=F×tR
調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention結(jié)構(gòu)time，t'R)——扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱(chēng)折合保留時(shí)間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件(溫度、固定相等)一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R(或tR)可用于定性。t'R=tR-t0
調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R=VR-V0或V'R=F×t'R
3.柱效參數(shù)
理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率(簡(jiǎn)稱(chēng)柱效)。
N取決于固定相的種類(lèi)、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類(lèi)和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對(duì)稱(chēng)并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：N=()2=16()2=5.54()2
N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。
N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。(一般HPLC柱的N在1000以上。)
若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱(chēng)為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。
理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長(zhǎng)的方差。H=。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H=，H有效=。
4.相平衡參數(shù)
分配系數(shù)(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。K=。
分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱(chēng)交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。
在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小)時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰;而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱;K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。
容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。k=。因此容量因子也稱(chēng)質(zhì)量分配系數(shù)。
分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)系：k===K=，t'R=k t0。上式說(shuō)明容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間(t'R)是不保留組分保留時(shí)間(t0)的幾倍。k=0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t'R=0;k越大，說(shuō)明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。
容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無(wú)關(guān);k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。
選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α==(設(shè)k2>k1)。因k=t'R/t0，則α=，所以α又稱(chēng)為相對(duì)保留時(shí)間(《美國(guó)藥典》)。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。
5.分離參數(shù)
分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R=。當(dāng)W1=W2時(shí)，R=。當(dāng)R=1時(shí)，稱(chēng)為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R=1.5時(shí)，稱(chēng)為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱(chēng)為完全分離。
《中國(guó)藥典》規(guī)定R應(yīng)大于1.5。
基本分離方程——分離度與三個(gè)色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系:
R=××
其中稱(chēng)為柱效項(xiàng)，為柱選擇性項(xiàng)，為柱容量項(xiàng)。柱效項(xiàng)與色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)特性有關(guān)，后兩項(xiàng)與色譜過(guò)程熱力學(xué)因素有關(guān)。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α=1時(shí)，R=0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值;b. 改變柱溫;c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0;k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1.塔板理論的基本假設(shè)
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過(guò)程看成在分餾塔中的分餾過(guò)程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過(guò)程。塔板理論的基本假設(shè)為：
1) 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔(即塔板高度)內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。
2) 樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。
3) 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。
4) 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。
雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過(guò)程不符，如色譜過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，很難達(dá)到分配平衡;組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。
2.色譜流出曲線方程及定量參數(shù)(峰高h(yuǎn)和峰面積A)
根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來(lái)描述：C=e或C=e
由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)t=tR時(shí)，濃度C有極大值，Cmax=。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說(shuō)明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)(即σ一定)，峰高h(yuǎn)與組分的量C0(進(jìn)樣量)成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，σ越小(柱效越高)，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對(duì)V(0~∞)求積分，即得出色譜峰面積A=×σ×Cmax=C0。可見(jiàn)A相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入上式，即得A=1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。
三、速率理論(又稱(chēng)隨機(jī)模型理論)
1.液相色譜速率方程
1956年荷蘭學(xué)者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬(即柱效)的影響。
后來(lái)Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程(H=A+B/u+Cu，后稱(chēng)氣相色譜速率方程)的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程(即Giddings方程)：H=2λdp++\s\up5(2p+\s\up5(2p+\s\up5(2f
2.影響柱效的因素
1)渦流擴(kuò)散(eddy diffusion)。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻(λ大)，且會(huì)使柱壓過(guò)高。大而均勻(球形或近球形)的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小。總的說(shuō)來(lái)，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無(wú)填料，A=0。
2)分子擴(kuò)散(molecular diffusion)。又稱(chēng)縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u=2γDm/u。u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)(u小)，展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm進(jìn)行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的γ=1。
3)傳質(zhì)阻抗(mass transfer resistance)。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過(guò)程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過(guò)程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。
①流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hm=Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來(lái)得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。
②靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質(zhì)阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分配色譜)，Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹(shù)脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣時(shí)間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過(guò)程。過(guò)高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ訦對(duì)u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很小(大約0.03~
